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Annexin V-PE/7-AAD凋亡檢測試劑盒說明書
Annexin V-PE/7-AAD Apoptosis Detection Kit
貨號:K2579
保存:2-8 ℃避光保存
組分說明
Cat.No. K2579
KitSize 50
4×BindingBuffer 10ml
7-AADViabilityStainingSolution 500 μl
AnnexinV-PE 250 μl
產(chǎn)品簡介
AnnexinV-PE/7-AAD 流式檢測試劑盒是一種采用 Annexin-PE 與 7-AAD 雙染法進行細胞早期凋亡分析的檢測試劑盒。
細胞凋亡早期改變發(fā)生在細胞膜表面,這些細胞膜表面的改變之一是磷脂酰絲氨酸(PS)從細胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細胞膜外,使 PS 暴露在細胞膜外表面。PS 是一種帶負電荷的磷脂,正常主要存在于細胞膜的內(nèi)面,在細胞發(fā)生凋亡時細胞膜上的這種磷脂分布的不對稱性被破壞而使 PS 暴露在細胞膜外。AnnexinV 具有易于結(jié)合到磷脂類如 PS 的特性,對 PS 有高度的親和性。因此,該蛋白可充當一敏感的探針檢測暴露在細胞膜表面的 PS。PS 轉(zhuǎn)移到細胞膜外不是凋亡所*的,也可發(fā)生在細胞壞死中。兩種細胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細胞膜是完好的,而細胞壞死在其早期階段細胞膜的完整性就被破壞。7-AAD (7-amino-actinomycinD)是一種核酸染料,可進入死細胞內(nèi)與 DNA 結(jié)合,能夠?qū)乃篮偷蛲鐾砥诘募毎M行染色。7-ADD 與PI有著相似的熒光特性,但其發(fā)射波譜較PI 窄,對其他檢測通道的干擾更小,在多色熒光分析中是PI 的最佳替代品,因此通常將Annexin V-PE 與 ADD 配合染色,以區(qū)別凋亡早期細胞與壞死細胞和凋亡的晚期細胞。
注意事項
1. 消化細胞時不能用含EDTA 的胰酶。
2. 本試劑盒需使用流式細胞儀進行檢測。
3. 需自備PBS 和去離子水。
4. 熒光染料均存在淬滅問題,保存和使用過程中請盡量注意避光,以減緩熒光淬滅。
5. PI 對人體有刺激性,請注意適當防護。
6. 請穿實驗服并戴一次性手套操作。
操作步驟
1. 細胞樣品的準備:
a. 對于貼壁細胞:小心收集細胞培養(yǎng)液到一離心管內(nèi)備用。用胰酶消化細胞,至細胞可以被輕輕用移液管或槍頭吹打下來時,加入前面收集的細胞培養(yǎng)液,吹打下所有的貼壁細胞,并輕輕吹散細胞。再次收集到離心管內(nèi)。1000×g 左右離心3-5 分鐘,沉淀細胞。對于特定的細胞,如果細胞沉淀不充分,可以適當延長離心時間或稍稍加大離心力。小心吸除上清,可以殘留約50μl 左右的培養(yǎng)液,以避免吸走細胞。加入約1 ml 4℃預(yù)冷的 PBS,重懸細胞,再次離心沉淀細胞,小心吸除上清。再次加入1ml4℃預(yù)冷的PBS,重懸細胞,再次離心沉淀細胞。
b. 對于懸浮細胞:1000×g 左右離心3-5 分鐘,沉淀細胞。對于特定的細胞,如果細胞沉淀不充分,可以適當延長離心時間或稍稍加大離心力。小心吸除上清,可以殘留約 50 微升左右的培養(yǎng)液,以避免吸走細胞。加入約1 ml 4℃預(yù)冷的PBS,重懸細胞,并轉(zhuǎn)移到1.5 毫升離心管內(nèi)。再次離心沉淀細胞,小心吸除上清,可以殘留約 50μl 左右的 PBS,以避免吸走細胞。再次加入1ml4℃預(yù)冷的PBS,重懸細胞,再次離心沉淀細胞。
2. 用去離子水按1:4 稀釋 BindingBuffer(4mlBindingBuffer+12ml 去離子水);
3. 用 250μlBindingBuffer 重新懸浮細胞,調(diào)節(jié)其濃度為1×106/ml;
4. 取 100 μl 的細胞懸液于 5ml 流式管中,加入 5 μlAnnexinV-PE 和 10 μl7-AAD 溶液;
5. 混勻后于室溫避光孵育 15 分鐘;
6. 在反應(yīng)管中加 400μlPBS,流式細胞儀(FACS)分析。
實驗代做服務(wù):
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